《海贼王》中草帽一伙第一次真正意义上的“分开”是在第405集（动画）,具体是：

• 第405集《消失的伙伴们 草帽小子一伙的末日》：在香波地群岛，巴索罗米·熊（暴君熊）用肉球果实能力将草帽一伙逐个拍飞到世界各地，路飞眼睁睁看着伙伴们一个个消失,这是草帽一伙第一次被强制拆散。

之后路飞在女儿岛经历了一系列事件，并在第516集《路飞开始修行 前往约定的地方》左右开始为期两年的修行，两年后伙伴们在第517集左右于香波地群岛重新集结，正式重聚是在第521集左右（动画第517集开始陆续汇合，第521集全员到齐出海）。

所以如果你问的是“草帽一伙第一次被拆散”，答案是第405集；如果是“路飞和伙伴们分开去修行”，则是第405集之后到第517集重聚之间。